1. 1 组织标本
组织芯片(DC-Dig00005,US Biomax)购自陕西爱维拉生物科技有限公司,含食道、胃脏、肝脏、胰腺、结肠和直肠6种消化系统恶性肿瘤及相匹配的癌旁正常组织的微阵列(1例2点,共60例120点).包括食道癌及对应癌旁组织10例,胃癌及其癌旁组织10例,肝癌及对应癌旁组织10例,胰腺癌及对应癌旁组织10例,结肠癌及对应癌旁组织10例,直肠癌及对应癌旁组织10例.另外,还包括正常胃组织6例、结肠组织5例、直肠组织2例、胰腺组织3例和肝组织2例的散片作为各种对照.组织芯片中每例的临床参数如年龄、性别、临床分期、病灶位置、病理分级、T-tumor、N-node和M-metastasis(TNM)分类等信息见表1.
表1 组织芯片的患者临床信息Table 1 Clinical characteristics of the patients in tested tissue array
1. 2 多重免疫组织化学染色法
运用单一的、特异性一抗和多重免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC),经过反复染色-洗脱-再染色的步骤,可在同一组织芯片上获得多种抗原与抗体的阳性反应结果;一抗孵育的次序依抗原信号由弱到强依次为STOML1、STOML2、TAF1L和MMP9,通过显微镜下拍照、记录、信号评分和数据统计完成.具体步骤如下:
1)将芯片置于60℃恒温干燥箱中干燥1 h;2)将芯片放入松节油(terpentine oil,TO)透明剂浸泡10 min,重复3次;
3)将芯片依次浸泡在体积分数为100%、95%和75%的乙醇中各5 min后,置缓慢水流中冲洗5 min,完成脱腊;
4)将芯片浸泡于体积分数为3%的H2O2溶液中,孵育30 min;
5)将芯片浸泡于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中,置水平摇床上慢速洗涤,重复3次,每次5 min;
6)将芯片浸泡于含柠康酐修复液(pH=7.5)的修复盒,移入已加水温热的蒸锅中央,直接加热30 min进行抗原热修复;
7)待芯片自然冷却后,重复步骤5);
8)用适量含triton X-100的磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline triton X-100, PBST; tri⁃ton X-100体积分数为0. 1%)稀释一抗,再加入体积分数为5%马血清和体积分数为10%的牛血清蛋白,配制成一抗的工作液,滴加至覆盖组织切片,置孵育湿盒中4℃过夜,重复步骤5);
9)在芯片上滴加适量的PV9000盒(Polink-2 DAB,ZSGB-BIO)试剂2,室温暗室孵育20 min,重复步骤5);
10)在芯片上滴加适量的PV9000盒试剂3,室温暗室孵育30 min,重复步骤5);
11)在芯片上滴加适量的3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC)显色液(A液1滴+B液2滴+C液1滴,混匀,加入1 mL双蒸水稀释),待阳性切片上出现可靠的阳性信号时终止显色反应,重复步骤5);
12)将芯片浸泡苏木素中染细胞核,静置10~20 s,然后用缓慢的流水洗涤10 min;
13)用预热60℃的甘油明胶封片;
14)用数字扫片仪(莱卡,Aperio CS2/EM AC20)记录、分析;
15)将芯片浸泡于预热65℃的水中,轻柔去除甘油明胶封片;
16)用体积分数为90%的酒精浸泡芯片5~15 min,镜下观察直至洗脱AEC红色信号;
17)重复步骤5)至步骤16),完成第2个抗体染色.
1. 3 免疫组织化学染色评分标准及数据分析
相关蛋白质在组织芯片中的阳性表达结果,采用染色强度积分和阳性细胞占比积分的乘积进行定量分析.定义特异性阴性显色为“−”时,染色强度积分为0;阳性信号为“+”时,染色强度积分为1;阳性信号为“++”时,染色强度积分为2;阳性信号为“+++”时,染色强度积分为3;阳性信号为“++++”时,染色强度积分为4.阳性细胞占比<10%时,积分为0;阳性细胞占比为11%~25%时,积分为1;阳性细胞占比为26%~50%时,积分为2;阳性细胞占比为51%~76%时,积分为3;阳性细胞占比为77%~100%时,积分为4.规定两者积分之积为0~3为阴性(低表达),大于3为阳性(高表达).
所有实验数据的定量分析均采用GraphPad Prism 6软件进行统计学处理,数据统计结果用xˉ± s表示,显著性差异检验两组间分析采用双尾学生t检验(student's t test)、多组间比较的单因素方差分析检验和卡方检验,以P<0. 05作为阈值,判断其是否具有统计学显著性差异.