从4 ℃冰箱中取出菌种,用接种环刮取菌苔接入到50 mL培养基中,置于30 ℃、150 r/min条件下振荡培养18 h,备用.

将活化菌悬液稀释,按体积分数1%接种到50 mL芽孢发酵培养基中,于30 ℃、150 r/min条件下振荡培养48 h,检测芽孢产量.

芽孢产量用芽孢浓度表征,具体过程为:取2 μL 待检芽孢悬浮液滴加在细菌计数板中心计数区,随机选取n个小格采用“计上不计下,计左不计右”的原则记录芽孢数量,计算芽孢浓度,为

S=(2N)/n×10⁷

其中, S为芽孢浓度; N为芽孢总数; n为格子数.

1)接种量.将活化后的菌悬液稀释成1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹和2×10⁹ mL^-1 4个浓度,按1%的体积比接种到对应的锥形瓶(250 mL)中,每瓶装有50 mL芽孢发酵培养基,接种后的芽孢初始浓度分别为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷和2×10⁷ mL^-1.

2)碳源.选取葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖和淀粉6种糖类和甲酸钠、乙酸钠、草酸钠、海藻酸钠、D-葡萄糖酸钠和L-乳酸钠6种有机酸盐作为碳源,质量浓度为1 g/L,进行碳源种类筛选; 获得优势碳源后,设置质量浓度为0.5、1.0、 2.0、 3.0、 4.0和5.0 g/L进行碳源浓度优化.

3)氮源. 选取硝酸钠、硝酸铵、尿素、牛肉膏、蛋白胨和酵母粉作为氮源,质量浓度为1 g/L,进行氮源种类筛选; 获得优势氮源后,设置质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g/L进行氮源浓度优化.

4)金属离子. Mg²⁺和Mn²⁺分别来源于六水合氯化镁和一水合硫酸锰,其中,Mg²⁺质量浓度为0.06、0.12、0.24、0.36和0.48 g/L, Mn²⁺质量浓度为1.6、3.2、4.8、6.4和8.0 mg/L.

在单因素实验的基础上,以芽孢浓度为考察指标,通过正交实验对接种量、淀粉、酵母粉、Mg²⁺和Mn²⁺的用量进行优化,每个因素选取3个水平,如表1.

表1 B8芽孢发酵培养基正交实验设计
Table 1 Orthogonal design of B8 sporulation medium

利用优化后的培养基生产芽孢,在4 ℃、7 000 r/min的条件下离心10 min,去掉上清液,用无菌水洗涤再离心,重复10次. 用灭菌的去离子水配置芽孢悬浮液,浓度为4×10⁹ mL^-1,保存在4 ℃冰箱中,备用.

在490 nm波长下,随着芽孢萌发率增加,光密度值逐渐下降. 实验中,利用光密度值的变化,判断芽孢萌发状态,并在相差显微镜下利用细菌计数板检测未萌发芽孢数,计算芽孢萌发率. 具体过程如下:将芽孢悬浮液(浓度4×10⁹ mL^-1)置于60 ℃水浴10 min,取200 μL至10 mL离心管中,再取1.8 mL芽孢萌发培养基至离心管中,摇匀后取200 μL至96孔板中,用多功能酶标仪每隔30 min测量1次D(490); 将装有芽孢的离心管置于30 ℃、150 r/min的条件下震荡培养,待萌发稳定后检测未萌发芽孢数(参照1.2.3),计算芽孢萌发率,为

G=1-S/(S₀)×100%

其中, G为芽孢萌发率; S为未萌发芽孢浓度; S₀为初始芽孢浓度.

1)萌发剂.分别选取L-丙氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和肌苷为萌发剂,质量浓度均为3 g/L,进行萌发剂种类筛选.获得优势萌发剂后,设置浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和5.00 g/L进行萌发剂浓度优化.

2)pH值. 将芽孢萌发体系的初始pH值分别调节为7、8、9、10、11、12和13,待萌发稳定后计算芽孢萌发率.

3)金属离子.芽孢的萌发也需要金属离子的参与,菌株筛选自金属离子种类多、含量高的滨海湿地,因此,以海水中金属离子的含量为依据,探究了Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Mn²⁺5种主要金属离子对芽孢萌发的影响. 在芽孢萌发体系中分别加入Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Mn²⁺,质量浓度分别为10.500、0.400、0.030、0.600和0.011 g/L. 其中,系列1只加金属离子,不加萌发剂,系列2同时添加金属离子和萌发剂,随后探究对芽孢萌发具有影响作用的金属离子的浓度效应. 待芽孢萌发稳定后,计算萌发率.

以上所有实验均重复3次.

如图5所示,随着萌发时间的增加,D(490)逐渐下降,芽孢萌发率逐渐增加,在4 h时萌发趋于稳定,芽孢萌发率超过85%. 通常芽孢萌发所需的时间较短,且不同菌种的芽孢之间存在差异. SHARMA等^[12]研究发现,科氏芽孢杆菌(B. cohnii)芽孢在3 h时,萌发率可达98%,而嗜碱芽孢杆菌(B. pseudofirmus)芽孢在20 h时才开始萌发,经过10 h才萌发完全. 本实验所用的B8芽孢萌发比较迅速,3 ～ 4 h就能萌发完全. 芽孢萌发时间与不同菌种芽孢内膜所含的营养萌发受体量有关,萌发受体量多,芽孢萌发就快,萌发受体量少,芽孢萌发所需时间长,甚至能使芽孢进入深休眠状态^[13]. 此外,芽孢萌发速率与所用萌发剂、无机盐、环境pH值和热处理等有关.

图5 芽孢萌发率和D(490)随萌发时间的变化
Fig.5 Time course of spore germination and D(490)

芽孢萌发的萌发剂大多为氨基酸类,本研究对9种萌发剂进行了考察,发现肌苷和L-丙氨酸能较好地促使芽孢萌发,其他几种氨基酸促萌发效果较差(图6). 对肌苷质量浓度作进一步考察发现,在0～0.1 g/L随着质量浓度的增加,芽孢萌发率迅速升高; 在0.1～2.0 g/L,芽孢萌发率增加变缓; 肌苷浓度高于2.0 g/L时,芽孢萌发率几乎不再增加. 可见,适宜的肌苷质量浓度为2.0 g/L. 不同菌种的芽孢所需萌发剂的种类和用量存在差异. 如科氏芽孢杆菌DSM6307(B. cohnii DSM6307)芽孢的最适萌发剂为肌苷,最适浓度为15 mmol/L,浓度过高反而抑制芽孢萌发^[14]. GOUNINA-ALLOUANE等^[15]发现,利用1～100 mmol/L的L-丙氨酸或0.01～10.00 mmol/L的肌苷能促使蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)迅速萌发. 除了糖类、氨基酸和嘌呤核苷等营养萌发因子,非营养萌发因子以及高压、热处理等物理因素也能诱导芽孢萌发.

图6 不同萌发剂和肌苷浓度对芽孢萌发的影响
Fig.6 Effects of different germinators and inosine concentration on spore germination

环境条件是影响芽孢高效萌发的因素之一,如图7,随着pH值的增加,芽孢萌发率呈先增后降的趋势. pH值为10时,芽孢萌发率最高,为86.25%; pH值为9和11时,萌发率分别为74.38%和65.63%,相对较高; pH值低于8或高于12时,芽孢萌发率急剧下降. 因此,芽孢萌发适宜的pH值范围为9～11. 不同菌种的生长环境不同,导致其芽孢萌发所需的pH值也存在差异. VERCAMMEN等^[16]研究发现,在800 MPa的高压下、pH值为4的缓冲液能促使凝结芽孢杆菌LMG6326(B. coagulans LMG6326)芽孢萌发. SETLOW等^[17]研究表明,pH值为7.3～7.5时,枯草芽孢杆菌(B. subtilis)芽孢开始萌发. 本实验所研究的菌株B8筛选于碱性环境,因此在碱性条件下更有利于该菌株芽孢的萌发.

图7 pH值对芽孢萌发的影响
Fig.7 Effect of pH on spore germination

图8显示了不同金属离子对芽孢萌发的影响.由图8可见,不加肌苷的系列中,芽孢几乎不萌发,可见芽孢萌发必须要有萌发剂的参与. 但除肌苷外,一些金属离子也会对萌发过程产生影响. 在加入肌苷的系列中,Na⁺的存在使芽孢萌发率高达75.42%; 加入K⁺、Mg²⁺和Mn²⁺芽孢萌发率分别为30%、34.67%和32%,与对照组的32.67%相近; 而加入Ca²⁺芽孢萌发率仅为6%,芽孢几乎不萌发. 可见Na⁺能促进芽孢萌发,但Ca²⁺严重抑制芽孢萌发,而K⁺、Mg²⁺和Mn²⁺对芽孢萌发无明显影响.进一步考察肌苷存在时不同Na质量浓度对芽孢萌发的促进作用. 如图8,随着Na⁺质量浓度的增加,芽孢萌发率呈先增后减的趋势. Na⁺质量浓度在0～3 g/L时,芽孢萌发率迅速升高; 在3～24 g/L时,芽孢萌发率缓慢下降; 当质量浓度高于24 g/L时,芽孢萌发率迅速下降. 其中,Na⁺质量浓度为3 g/L时,芽孢萌发率最大,为89.17%; 质量浓度为0.6 g/L和24.0 g/L时,也具有较高的萌发率,分别为77.29%和73.75%. 由此可见,B8芽孢对Na⁺质量浓度的耐受范围较宽,在0.6～24.0 g/L皆能保持较高的萌发率.

图8 不同金属离子对芽孢萌发的影响
Fig.8 Effects of different metal ions on spore germination

在混凝土内部环境中,Ca²⁺的含量较高(如普通水泥中,CaO的质量分数高达50%～55%),这将对芽孢萌发造成严重抑制. 芽孢如果不能萌发并生长为营养细胞,就无法诱导碳酸钙的生成,从而大幅降低微生物自修复的效率,因此,必须采取措施解除Ca²⁺对芽孢萌发的抑制作用. 由图8可知,Na⁺对芽孢萌发具有明显的促进作用,因此本研究利用Na⁺的促进作用来抵消Ca²⁺的抑制作用. 如图9,在含有0.6 g/L的Ca²⁺体系中加入10.6 g/L的Na⁺,芽孢萌发率从对照组的6.00%左右上升到30.67%,而加入K⁺、Mg²⁺和Mn²⁺的芽孢萌发率分别为5.33%、4.00%和6.67%,与对照相近,对芽孢萌发无促进作用. 由此可见,Na⁺确实能在一定程度上解除Ca²⁺对芽孢萌发的抑制. 从文献调研的情况来看,这是首次证实Na⁺具有消除Ca²⁺对芽孢萌发抑制的作用.

图9 含Ca2+体系中,共存金属离子对芽孢萌发的影响
Fig.9 Effects of co-existing metal ions on spore germination in the presence of Ca2+

在确定Na⁺能有效解除抑制后,进一步考察了不同质量浓度Na⁺的抑制解除效果. 如图9,在含有0.6 g/L的Ca²⁺体系中,随着Na⁺质量浓度增加,芽孢萌发率呈先增后减的趋势. 当Na⁺质量浓度为24.0 g/L时,芽孢萌发率最高达到82.71%,基本恢复到无Ca²⁺抑制的水平,表明在此质量浓度时,Ca²⁺对芽孢萌发的抑制作用被完全解除.

芽孢萌发过程通常伴随有H⁺和K⁺等一价阳离子从芽孢内核释放,这可能与芽孢内膜上的离子转运蛋白有关. SOUTHWORTH等^[18]研究发现,在蜡状芽孢杆菌(B. cereus)芽孢中存在一种Na⁺和K⁺的反向转运蛋白GerN,外界Na⁺内流促使H⁺、K⁺释放,促进芽孢萌发,在其他种属的细菌芽孢中也可能存在类似的离子转运蛋白. SHARMA等^[12]研究表明,嗜碱芽孢杆菌(B. pseudofirmus)芽孢萌发需要Na⁺存在,在萌发体系中加入0.10 mol/L NaCl,芽孢萌发率高达99%,加入0.05 mol/L NaCl,芽孢萌发率为82%,不添加NaCl,芽孢不萌发. 本实验中,Na⁺能促进B8芽孢的萌发,也可能是芽孢内膜上存在相关离子转运蛋白,通过Na⁺内流促使内核中其他阳离子外排,伴随着内核吸水,促进萌发.

在芽孢形成过程中,内核生成2,6-吡啶二羧酸(pyridine-2,6-dicarboxylic acid, PDA),会吸收Ca²⁺,以1:1结合生成螯合物Ca²⁺-PDA,而芽孢萌发伴随着Ca²⁺-PDA的释放,当外界存在Ca²⁺时,会抑制Ca²⁺-PDA的释放,进而抑制萌发^[13]. 本实验表明,当环境中存在Na⁺时,相关离子转运通道可能被开启,使内核中H⁺和K⁺等离子释放的同时可能也导致了Ca²⁺-PDA释放,引起内核吸水,从而解除Ca²⁺的抑制作用,最终促使芽孢萌发.