对翡翠贻贝足部组织提取的RNA进行转录组测序,获得55 670 668个原始数据(raw reads),测序质量值Q₂₀=98.19%, GC值为42.18%.通过过滤,获得53 047 718个clean reads,使用Trinity软件进行从头组装,获得73 571个广泛通用的基因数据库(Universal Genes,UniGenes).将翡翠贻贝足部的UniGenes注释到基因本体(gene ontology, GO)数据库,共获得9 466个注释结果,并分为51个亚类,这51个亚类归属于生化进程、细胞组成和分子功能3个功能.进一步通过KEGG注释后,发现有955个UniGenes被注释到黏着斑通路中,推测足丝蛋白黏附重金属的功能与其密切相关.综合来看,GO和KEGG途径的注释为进一步明确翡翠贻贝中特定细胞结构、通路和蛋白质功能提供了有用信息.

将实验得到的翡翠贻贝足部转录组和已公布的紫贻贝足丝蛋白序列进行blastx同源性搜索,结果如表1.最终挑选序列长度适中,半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸含量高的足丝蛋白Pvfp6进行后续研究.

表1 贻贝足丝蛋白的鉴定
Table 1 Identification of byssal proteins from Chinese green mussel

Pvfp6分子质量约为11 ku,pH(I)=5.60,其信号肽由17个氨基酸残基组成,主要涉及足丝蛋白的分泌机制.Pvfp6富含14%的半胱氨酸和8.2%的酪氨酸.半胱氨酸具有金属结合能力和氧化还原活性,将结合的重金属螯合成无毒的配合物,起到降解重金属毒性的作用^[14].黏附蛋白序列中的酪氨酸具有羟基化的翻译后修饰特征,其被羟基后形成3,4-二羟基苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenyl alanine,DOPA,多巴),正是DOPA的存在才赋予了贻贝足丝蛋白强的黏附功能以及对重金属等可能具有的吸附作用^[15].

按照1.2.2节的方法得到PCR扩增产物.编码基因pvfp6的PCR产物在300 bp处出现条带,与转录组测序所得基因大小一致.提取pET-30a质粒后,将pvfp6的PCR产物定向克隆至pET-30a中,构成重组质粒.

将连接后的重组质粒转入感受态细胞,然后涂布在含有100 μg/mL卡那霉素的LB平板上过夜培养菌体.挑取重组菌单菌落转化子,提取转化子质粒DNA作为模板进行PCR扩增验证,再将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳.如图1,重组菌在300 bp处出现条带,说明所挑取单菌落转化子为阳性重组菌.最后,把重组菌的质粒分别送去测序.将已转入pvfp6基因的阳性重组子命名为P6.测序结果显示,P6重组菌成功构建,没有发生任何碱基突变.

图1 重组质粒 pvfp6的PCR产物电泳检测
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of target gene pvfp6

对重组菌P6(含pET-30a-pvfp6)进行诱导表达,以转入空载体pET-30a的E.coli. BL21为对照菌株,并进行SDS-PAGE电泳,结果如图2.由图2可见,工程菌P6在11 ku处附近有特异条带,而对照菌在该位置无条带,电泳检测结果与理论值基本相符,表明Pvfp6足丝蛋白已成功表达.

图2 SDS-PAGE分析Pvfp6蛋白于BL21表达情况
Fig.2 SDS-PAGE analysis of Pvfp6 protein expression in BL21

图3给出P6重组菌与对照组30a在不同Hg²⁺质量浓度下的生长曲线.由图3可见,重组菌P6对Hg²⁺的最大抗性为5 mg/L,而对照组30a对Hg²⁺的最大抗性仅2 mg/L,且随着Hg²⁺质量浓度的升高,重组菌体进入对数期的时间比对照组30a更短,表明P6经表达足丝蛋白后抗汞能力有了一定程度的增强.

图3 P6重组菌与对照组30a在不同Hg2+质量浓度下的生长曲线
Fig.3 Growth curves of P6 recombinant bacteria and control group 30a under different Hg2+ conditions

图4给出了P6重组菌与对照组30a在不同Cd²⁺质量浓度下的生长曲线.由图4可见,重组对照菌pET-30a对Cd²⁺的最大抗性为120 mg/L,而P6重组菌对Cd²⁺的最大抗性为160 mg/L.P6重组菌对Cd²⁺的最大抗性高于对照组30a,说明P6重组菌表达的足丝蛋白确实具有镉抗性.

从实验的抗性结果可见,重组菌相比对照菌株具有更强的抗重金属能力,但要在含Hg²⁺的环境下生存和繁殖,需要一定的时间进行诱导和适应.重金属浓度越高,越容易出现生长迟滞的现象.随着Hg²⁺和Cd²⁺质量浓度的升高,最大生长菌量减少,究其原因可能是细菌在降解重金属毒性物质时,占用了大量的营养物质和能量,影响细菌的生长.另外,P6重组菌表达的足丝蛋白富含大量的半胱氨酸和组氨酸残基,能将进入细胞中的非必需有毒金属离子结合,减少细胞与有毒金属的接触,从而保护细胞免受金属离子的毒性^[16].

图4 P6重组菌与对照组30a在不同Cd2+质量浓度下的生长曲线
Fig.4 Growth curves of P6 recombinant bacteria and control group 30a under different Cd2+ conditions

对P6重组菌的Hg²⁺和Cd²⁺富集能力的实验研究表明,重组菌的重金属的富集能力较宿主菌有一定的提高.重组菌对Hg²⁺的平衡富集量为109.89 mg/g,比对照组93.46 mg/g提高了17.58%; 对Cd²⁺的平衡富集量为19.27 mg/g,比对照组16.50 mg/g提高了16.79%.在本研究中,如图5所示,重组菌P6和对照菌30a在一定的Hg²⁺和Cd²⁺质量浓度范围内对重金属离子的富集符合Langmuir吸附模型.随着溶液中Hg²⁺和Cd²⁺质量浓度的增加,菌体对重金属离子的吸附量也增加,当离子浓度达到一定量时,吸附达到平衡并趋于饱和状态.总的来说,P6重组菌对Hg²⁺和Cd²⁺的富集量均高于对照组30a.富集量的增加可能是因为进入胞内的重金属能被足丝蛋白中的半胱氨酸、组氨酸以及酪氨酸结合,从而表现为重组菌细胞对Hg²⁺和Cd²⁺的富集容量增加^[17].

图5 P6重组菌与对照组30a的Hg2+和Cd2+的平衡富集量
Fig.5 Equilibrium accumulation of P6 recombinant bacteria and control group 30a