1)深圳大学生命与海洋科学学院,广东深圳518055; 2)汕头大学医学院预防医学教研室,广东汕头515041; 3)汕头大学医学院附属肿瘤医院,广东汕头515000
1)College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518055, Guangdong Province, P.R.China2)Department of Preventive Medicine, Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, P.R.China3)Pathology Laboratory, Cancer Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515000, Guangdong Province, P.R.China
pathophysiology; esophageal squamous cell carcinoma; miRNA; bioinformatics; pathway in cancer; biomarkers
DOI: 10.3724/SP.J.1249.2019.04347
为寻找食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)诊断与治疗的新分子标志物,利用实时定量荧光PCR技术检测ESCC中3个未知miRNAs(miR-3914、 miR-8082和miR- 4770)的表达状况; 运用生物信息学方法分别对它们差异表达miRNA下游的候选靶基因做基因本体(gene ontology, GO)富集和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析; 采用蛋白免疫印迹方法观察转染miRNA mimic后一些与癌症发生和发展相关蛋白的表达改变.结果显示,与食管癌癌旁正常组织和正常食管上皮细胞比较,在ESCC组织/细胞中的miR-3914和miR-8082表达均呈显著性降低(P<0.05), 但miR- 4770无明显的表达变化.GO富集分析发现,miR-3914和miR-8082参与RNA聚合酶II启动子转录、蛋白结合和细胞凋亡等生物学过程; KEGG富集分析发现,miR-3914和miR-8082两者均与癌症相关通路有关, 且均可调控LAMC2、 CCDC6和PDGFB基因.当ESCC细胞分别转染miR-3914 mimic和miR-8082 mimic后,与未转染组比较,p53蛋白质表达增加,而c-Myc和Bcl-2蛋白质表达降低.研究结果表明,miR-3914和miR-8082各自均具有成为辅助ESCC早期诊断与精准治疗生物靶标的潜能.
In order to find novel biomarkers for the diagnosis and treatment of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC), qRT-PCR was used to detect the expression of three unknown miRNAs(miR-3914, miR-8082 and miR-4770)in ESCC. GO(gene ontology)and Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)enrichment analyses were performed to evaluate and predict biological functions of targeted genes in differentially expressed miRNAs. Westernblot was used to analyzecancer-related protein expression after miRNA mimic transfection. Results showed that miR-3914 and miR-8082 were significantly decreased in ESCC tissues/cells compared with normal esophageal tissues/cells(P<0.05). Data of GO enrichment analysis revealed that miR-3914 and miR-8082 could participate in RNA polymerase II promoter transcription, protein binding, cell apoptosis and other biological processes. KEGG pathway analysis displayed that both miR-3914 and miR-8082 were associated with pathway in cancer, simultaneously regulated to LAMC2, CCDC6 and PDGFB genes. After transfection of miR-3914 and miR-8082 mimic, the expression of p53 protein was increased and accompanied with the decreases of c-Myc and Bcl-2proteins in ESCC cells compared to untreated cells. Taken together, both miR-3914 and miR-8082 may become novel potential biomarkers for helping early diagnosis and precision treatment of ESCC.
食管癌是当今最常见的恶性消化道肿瘤之一,依病理分型,主要分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌两大类[1].全球范围内的食管癌约90%是ESCC,中国亦是如此[1-2].尽管食管癌的诊断和治疗手段目前已有很大改进,但是多数患者仍是在中晚期才被发现,通常已伴有癌症的局部侵袭和远端转移.因而,食管癌患者的5年生存率仅为15%～25%[3].于是,通过寻找新的生物标记物,提高早期诊断的精准率,揭示及干预疾病分子调控机制,是降低食管癌死亡率的有效途径.
microRNA(miRNA)是一类全长约18～24个核苷酸的内源性非编码小RNA,主要通过与下游信使RNA(mRNA)3'非编码区(3'UTR)互补结合,导致直接抑制蛋白质翻译或转录本的降解,以调整下游基因的表达.越来越多的证据支持miRNAs是肿瘤发生和癌症进展的关键调节因子,也是人类癌症中有用的诊断和预后标志物[4-7].本研究前期运用miRNA芯片(上海康成生物工程有限公司生产),从食管鳞癌组织与癌旁正常组织比较的差异表达谱中,筛选出miR-3914、miR-8082和miR- 4770三个有显著性差异表达的miRNAs,结果提示,它们可能与ESCC病变的发生发展相关.但是,目前尚无关于miR-3914、miR-8082和miR- 4770在肿瘤研究领域的报道.本研究旨在扩大样本量,进一步检测并分析miR-3914、miR-8082和miR- 4770在ESCC中的表达变化,通过生物信息学方法预测它们潜在的分子调控功能.
实验所用的40对食管鳞癌组织和癌旁正常组织标本均采集自汕头大学医学院附属肿瘤医院,并已获得汕头大学医学院医学伦理委员会的许可和患者本人或家属的知情同意.
外科手术切除的新鲜组织,由有经验的病理医生分离,然后迅速置于RNAwait保护液中,-20 ℃过夜,再置于-80 ℃长期保存待用.实验所用食管正常上皮细胞Het-1A源自ATCC,ESCC细胞系KYSE180和KYSE150均系汕头大学医学院许丽艳教授惠赠.
RPMI-1640培养基、青霉素、链霉素和胰酶均购自美国Hyclone公司.胎牛血清和转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司.miRNA mimic、miRNA NC及其引物均购自上海生工生物工程有限公司.AllPrep DNA/RNA Mini Kit试剂盒购自德国 Qiagen公司.Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ定量试剂均购自日本Takara公司.p53、c-Myc、Bcl-2和GAPDH抗体均购自美国CST公司.二抗购自上海碧云天生物技术有限公司.
Het-1A、KYSE180和KYSE150细胞系均使用包含体积分数为10%的胎牛血清和100 units/mL(约60 μg/mL, 1 mg=1 670 units)青霉素与100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基,在37 ℃,体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养.
使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)提取总RNA; 使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit进行逆转录; 根据逆转录试剂盒说明书设计qRT-PCR特异性5'-引物序列,如表1,使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit进行qRT-PCR分析; 以U6(逆转录试剂盒提供)为内参计算miRNA相对表达量.
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表1 qRT-PCR检测miRNAs所需特异性5'-引物序列
Table 1 5'-primer sequences for miRNAs detection by qRT-PCR
利用TargetScan(http://www.targetscan.org/)和RNA22(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)数据库,预测差异表达miRNA的靶基因.利用DAVID 6.8(http://david.ncifcrf.gov)对差异表达miRNA的靶基因进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)信号通路富集分析,再利用Cytoscape软件建立基因调控网络.
将2×105个KYSE180细胞接种于6孔板中,待细胞铺满70%～90%时,按照lipofectamine 2000说明书进行转染.48 h后提取细胞的总蛋白质.
细胞转染后的细胞总蛋白质置于体积分数为10% 的SDS-PAGE胶进行电泳,转膜至硝酸纤维素膜上.用体积分数为5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)于室温封闭1.5 h,一抗孵育,4 ℃过夜.用含体积分数为0.1%吐温的Tris-Hcl缓冲溶液(Tris buffered saline Tween, TBST)洗膜,二抗室温封闭1 h,再使用ECL(electrochemiluminescence)化学发光底物使印迹条带可视化,并采用Tanon化学发光检测系统进行成像分析.
运用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计学处理,结果以“均数±标准差”表示.显著性差异检验分别采用两组间比较的Student's t-test检验和多组间比较的One-way ANOVA检验.设定P<0.05为具有统计学显著性差异.
运用qRT-PCR法对40对ESCC组织和匹配的癌旁组织进行相对表达量分析,结果如图1.由图1(a)和(b)可见,与癌旁正常组织相比,miR-3914和miR- 8082在ESCC组织中的表达呈显著下调(P<0.05).由图1(c)可见,miR- 4770的表达无统计学显著性差异.由图1(d)可见,以配对的正常食管癌旁组织为参照1.000,miR-3914、miR-8082和mirR- 4770的倍数变化分别为0.492、0.665和0.895,如图1(d).
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图1 miR-3914和miR-8082在ESCC组织和配对癌旁正常组织中的表达
Fig.1 Expressions of miR-3914 and miR-8082 in ESCC tissues and matched adjacent
normal tissues
通过对ESCC细胞系的表达检测结果(图2)分析发现,与正常食管上皮细胞Het-1A比较,miR-3914和miR-8082在ESCC细胞中的表达显著下调(P<0.01). 其中,以Het-1A细胞表达量为参照1.000,miR-3914在ESCC细胞KYSE180和KYSE150中的表达量分别为0.213和0.538; 而miR-8082在ESCC细胞KYSE180和KYSE150中的相对表达量分别为0.491和0.345.
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图2 miR-3914和miR-8082在ESCC细胞系中的表达
Fig.2 Expressions of miR-3914 and miR-8082 in ESCC cell lines
利用TargetScan和RNA22数据库,预测miR-3914和miR-8082的下游靶基因.通过对两个数据库的交集分析,发现miR-3914有434个下游靶基因,而miR-8082有1 740个.从生物过程和分子功能方面对两个miRNAs的靶基因进行GO分析,发现miR-3914和miR-8082均参与RNA聚合酶II启动子转录、蛋白结合和细胞凋亡等过程(分析结果请扫描论文末页右下角二维码).
将miR-3914和miR-8082的下游靶基因进行KEGG通路分析,结果见表2.由表2可见,miR-3914靶基因主要富集在癌症相关信号通路、泛醌和其他萜醌生物合成信号通路、肾细胞癌信号通路、黏着斑信号通路和阿米巴病信号通路; miR-8082靶基因主要富集在神经营养因子信号通路、胰腺癌信号通路、破骨细胞分化信号通路、甲状腺激素信号通路、ErbB信号通路、黑色素瘤信号通路及癌症相关信号通路等.其中,miR-3914和miR-8082下游靶基因均呈与癌症相关信号通路相关,P<0.05.
图3是miR-3914和miR-8082对癌症相关通路富集的基因调控网络图.由图3可见,miR-3914和miR-8082在癌症相关通路调控的基因数分别为17个和52个,且两个miRNA均可调控LAMC2、 CCDC6和PDGFB基因.
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表2 miR-3914和miR-8082下游靶基因的KEGG分析
Table 2 KEGG pathway analysis of miR-3914 and miR-8082 targeted genes
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图3 miR-3914和miR-8082对癌症相关通路富集的基因调控网络图
Fig.3 Network map of miR-3914 and miR-8082 enriched genes from pathways in cancer
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图4 miR-3914和miR-8082对与癌症发病相关的关键蛋白质的表达影响
Fig.4 Effects of miR-3914 and miR-8082 on expression of ESCC-related key proteins
通过与mRNA 3'UTR互补结合,miRNAs可以同时与几个或数百个基因相互作用,并调节机体发育、生理和病理过程,包括细胞增殖、分化、凋亡、先天性或适应性免疫反应等[8].目前,人类基因组包含至少1 500个带注释的miRNA基因[9],其在肿瘤中的异常表达对多数肿瘤的发生发展有着重要影响[10-12].多项研究表明,miRNAs与ESCC的肿瘤转移和患者存活率相关.例如,miR-874-3p在ESCC中是低表达,与淋巴结转移、临床分期和总存活率关联,可作为ESCC患者的独立预后因素.体外实验miR-874-3p的过表达可显著抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭[13].miR-92b-3p可通过靶向ITGAV抑制ESCC的侵袭和转移,且有良好的预后作用[14].miRNA-508通过连续激活PI3K/Akt信号通路可促进肿瘤的侵袭表型,并与ESCC患者的不良生存密切相关[15].本研究发现,与癌旁正常组织相比,miR-3914和miR-8082在ESCC组织中的表达呈显著降低,而miR- 4770的表达则无明显差异.由此提示,miR-3914和miR-8082很可能参与ESCC发生和发展的分子调控机制.另外,与正常食管上皮细胞比较,miR-3914和miR-8082在ESCC细胞系KYSE150和KYSE180中的表达均呈显著性降低,进一步证明了miR-3914和miR-8082与ESCC的病变有密切关系.
利用生物信息学技术,通过对Targetscan和RNA22数据库的预测整合分析,本研究发现,miR-3914具有434个靶基因和miR-8082具有1 740个靶基因.进一步的GO分析发现,miR-3914和miR-8082可参与RNA聚合酶II启动子转录、蛋白结合和细胞凋亡等过程.KEGG通路分析发现,miR-3914和miR-8082均与癌症相关的信号通路相关联,可参与调控LAMC2、 CCDC6、 PDGFB基因.研究表明, LAMC2、 CCDC6和PDGFB基因与肿瘤的发生、发展及诊断预后密切相关: LAMC2过表达可预测结直肠癌患者预后不良,促进癌细胞增殖、迁移和侵袭[16],且在中国高危食管鳞癌患者中LAMC2 mRNA及蛋白过表达,其蛋白表达模式在ESCC患者预后中起重要作用[17].CCDC6在DNA损伤调控方面发挥着重要作用,其缺失或失活可通过抑制细胞凋亡促进肿瘤恶化,是一种有潜力的候选生物标志物[18].另有研究表明,PDGFB的mRNA表达水平在淋巴样母细胞和肿瘤组织中均降低,其基因变异可能对胰腺癌的易感性有影响[19].因此,深入调研miR-3914和miR-8082调控肿瘤相关基因LAMC2、 CCDC6和PDGFB的作用机制,对食管鳞癌精准诊疗可提供新的理论依据和技术手段.
癌症相关信号通路涉及细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及血管生成等多个细胞生物学过程.p53、c-Myc和Bcl-2蛋白质作为信号通路中的关键因子,在肿瘤的发生和发展中发挥着关键作用.原癌基因c-Myc是一种可调节且可易位的基因,诱导c-Myc的表达下调,可停滞细胞周期的G0/G1期,进而影响细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡的调控[20-21].现已公认p53作为一种重要的肿瘤抑制基因,在肿瘤的发生中具有双刃剑的特性. CHAVA等[22]研究结果显示,抑癌基因p53可作为食管癌发生发展的预后标志物.Bcl-2家族在细胞凋亡过程中同样发挥至关重要的作用.当肿瘤发生时,存在着Bcl-2的表达上调和Bax的表达下调,而减小Bcl-2/Bax的比值,会有利于抑制肿瘤的发展进程[23].并且,许多研究表明,miRNA可通过调控下游p53、c-Myc和Bcl-2蛋白质的表达,参与肿瘤的发生、转移和预后等过程[24-26].本研究也通过在ESCC的细胞转染miR-3914 mimic和miR-8082 mimic的体外实验发现,与未转染组细胞相比,p53蛋白质表达增加,c-Myc和Bcl-2蛋白质表达降低. 此结果与已报道的在其他肿瘤上的发现[24-26]相吻合,进而证明了miR-3914和miR-8082 与食管鳞癌的发生发展密切相关.
本研究通过检测食管鳞癌组织和细胞中miR-3914和miR-8082的表达,并利用生物信学方法对其下游靶基因进行相关分子生物学功能的预测,结果表明,两者在食管鳞癌中的异常表达与该病的病变密切相关,均具有成为食管鳞癌诊断治疗新生物标记物的潜能,因而可继续深入研究,以揭示它们在该病的分子调控机制.本研究为食管鳞癌的分子诊断与治疗新方案提供了实验依据.
深圳大学学报理工版
JOURNAL OF SHENZHEN UNIVERSITY SCIENCE AND ENGINEERING
（1984年创刊 双月刊）
主 管 深圳大学
主 办 深圳大学
编辑出版 深圳大学学报理工版编辑部
主 编 李清泉
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