聚醚砜购自吉林大学湖南中试化工厂; 纳米羟基磷灰石(纯度97%)购自南京埃普瑞纳米材料有限公司; N, N-二甲基甲酰胺(DMF; 分析纯500 mL), 购自天津市永大化学试剂有限公司; MG- 63成骨细胞购自上海生命科学院; RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司; 小牛血清购自美国Thermo Fisher公司; 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)购自美国Hyclone公司; 噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide, MTT)购自美国Sigma公司; 二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)购自美国Amresco公司.真空干燥箱和高压灭菌锅(HV-50)购自日本Hirayama公司; 红外光谱仪(Sectrum One Version B型)购自日本日立公司; 同步热分析仪(STA409PC型)购自德国NETZSCH.

以DMF为溶剂,加入nHA超声处理至形成均匀的悬浊液; 以DMF为溶剂,加入聚醚砜,缓慢加热至聚合物充分溶胀,溶解成均一、稳定、透明的溶液; 将nHA悬浊液与聚醚砜溶液混合,冷凝回流并搅拌,150 ℃反应2 h后铸膜; 制得HA质量分数分别为10%、20%和30%的PES-HA复合材料,记作复合材料A、B和C.

采用红外光谱仪对PES-HA复合材料进行测试,波数范围为400～4 000 cm^-1,扫描10次.

以Al₂O₃为参比物,采用同步热分析仪对PES和3种PES-HA复合材料进行热重分析,实验在氮气(流速为30 mL/min)气氛中进行,测试范围为300～800 ℃,分别以5、10、20和40 ℃/min的升温速率对样品进行扫描,记录测量结果.

参照GB/T 1447—2005标准^[9],将样品制成Ⅱ型试样形式,采用万能电子拉力机,以5 mm/min速率启动拉伸实验.拉伸强度公式为

δ=F/(bd)(1)

其中, δ为拉伸强度(单位:MPa); F为试样在拉伸至断裂中受到的最大力(单位:N); b和d分别为试样宽度和厚度(单位:mm).

将HA、PES和3种PES-HA复合材料进行高压灭菌,用RPMI1640培养液制备材料浸提液.培养MG- 63细胞生长至对数期,弃原培养液,用PBS洗涤两次,胰蛋白酶消化贴壁细胞,用完全培养基配制成单个细胞悬液,细胞板计数,每孔2×10⁴个接种在96孔板上(n=6), 每孔体积200 μL. 24 h后细胞贴壁,换用材料浸提液分别连续培养1、2、3和4 d后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),37 ℃孵箱中继续孵育4 h,弃上清液,每孔加入150 μL DMSO,摇床震荡10 min,使结晶物充分溶解.选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光密度值D(490), 并记录结果.

图1是HA、PES和PES-HA复合材料的红外光谱图.其中,1 578和1 486 cm^-1是苯环C=C的伸缩振动的谱带; 1 323和1 299 cm^-1是反对称的S—O—S伸缩振动特征谱带; 900～800 cm^-1为取代苯环H的C—H振动的特征峰,显示该复合材料存在聚醚砜成分.1 095、605和570 cm^-1均为PO₄^3-的特征峰,说明该复合材料中存在羟基磷灰石材料含有的PO₄^3-结构特征.该复合材料含有PES-HA的基本结构单元,没有聚醚砜和羟基磷灰石之外的特征峰,说明PES-HA复合材料主要为物理结合.

图1 HA、PES和PES-HA复合材料的红外光谱图
Fig.1 Infrared spectroscopy of HA, PES and PES-HA composites

PES-HA生物复合材料具备良好的热稳定性,在长期的机体环境及成型过程中能耐热耐高温.升温速率为20 ℃/min时,PES-HA复合材料热重曲线和热失重相关数据如图2和表1.聚醚砜外推起始分解温度t_e≈521 ℃, 热稳定性能良好. 在PES-HA复合材料中,随着w(HA)增加,其外推起始分解温度会随之升高,最大分解速率k、 最大分解速率对应的温度t_m和最小剩余率w_r也随之增加.这些TG曲线均呈台阶式走向,具有分解起始拐点和结束拐点,至分解结束拐点后趋于平缓,在736 ℃时仍不能完全分解. 其中,PES的最小剩余率低,w(HA)高的PES-HA复合材料的PES最小剩余率高.

图2 PES和PES-HA复合材料热失重曲线
Fig.2 TG curves of PES and PES-HA composites

表1 PES和PES-HA复合材料热失重数据
Table 1 TG data of PES and PES-HA composites

升温速率对PES及PES-HA复合材料热分解有重要影响.分别测量升温速率为5、10、20和40 ℃/min时, PES及PES-HA复合材料在不同升温速率下的热失重数据见表2. 随着升温速率的提升,外推起始温度和最大分解速率都不断升高,最小剩余率基本保持不变,失重曲线向高温区平移.热分解过程不仅表现在临界起始分解温度,而且表现在预分解时间.加热速率增加,不能提供足够的预分解时间,热分解呈滞后状态,在热分解曲线上表现为热分解在较高温区域进行.加热速率较慢,反映的热分解起始温度在时间上的滞后性.升温速率越快的热分解反应,会在短时间内结束,表现为热分解速率加快.

反应的动力学方程是由反应机理决定的,根据反应的热分析动力学方程

dα/dt=k(1–α)ⁿ(2)

其中, dα/dt为反应速率; k为速率常数; α为热分解率; n为反应级数.

k随温度的变化规律可用Arrhenius方程^[10]表示

k=Ae^-E/(RT)(3)

其中, A为频率因子(或称指前因子); E为反应活化能; R为气体常数; T为反应时的绝对温度.

用Kissinger法^[12]求热力学参数,由式(3)可得

ln((β_i)/(T ²_pi))=ln(AR)/E-E/R1/(T_pi)

i=1, 2, …, 4(或5和6)(4)

其中, β_i为升温速率(一般为常数); T_pi为等压条件下的绝对温度.

由ln((β_i)/(T ²_pi))对1/(T_pi)作图可得到一条直线,根据直线斜率和截距可分别求得E和A.

表2 PES和PES-HA复合材料不同升温速率的热失重数据
Table 2 TG data of PES and PES-HA composites at different heating rates

当-E/(nR)2T时,右边为一常数,由ln β_i对1/(T_pi)作图,利用直线斜率可求得n.

(dln β_i)/(d(1/T_pi))=-E/(nR)-2T(5)

根据表2数据、式(4)和式(5)可求得PES-HA复合材料热分解力学参数,如表3.PES-HA复合材料热分解反应级数为1,不随w(HA)变化而改变; 当w(HA)增加时,复合材料活化能增加,热稳定性增加.

表3 PES-HA热分解动力学参数
Table 3 PES-HA thermal decomposition kinetics parameters

表4为PES和PES-HA复合材料力学性能.随着w(HA)增加,PES-HA复合材料的断裂伸长率和拉伸强度均降低,弹性模量增加.在该复合材料中,PES与HA为物理结合,纳米HA颗粒分散在PES基体中.HA为分散相,PES为连续相,随着w(HA)增加,PES链段间作用力减弱,其拉伸强度有所降低, w(HA)越高,这种链段间作用力减弱愈加明显.当w(HA)=10%时,复合材料的拉伸强度为65 MPa,弹性模量为1.48 GPa,可达到一些承力较低的骨的力学条件,如松质骨、颈骨和腰骨等^[12-14].

表4 PES和PES-HA复合材料力学性能
Table 4 Mechanical properties PES and PES-HA composites

细胞相对增殖率(relative growth rate, RGR)能够反映细胞增殖活性,可由D(490, 样品组)/D(490, 对照组)计得^[15]. 毒性分级根据细胞相对增殖率大小取定一个范围,一般相对增殖率越高,毒性分级越低.细胞毒性分级标准^[16]为:RGR≥100%为0级,75%～99%为Ⅰ级,50%～74%为Ⅱ级,25%～49%为Ⅲ级,1%～24%为Ⅳ级,0为Ⅴ级.0级和Ⅰ级表示无细胞毒性; Ⅱ级需要结合细胞形态分析综合评定; Ⅲ级以上表示有细胞毒性.本实验中各组材料细胞毒性均为Ⅰ级,对细胞无毒性,见表5.由表5可见,样品中HA的RGR相对最高,PES-HA复合材料的RGR高于PES,随着HA质量分数的增加,其RGR逐渐升高,毒性逐渐降低.

材料对细胞的毒性可以反映在对细胞形态的影响上,通过观察细胞形态可直观判断材料毒性,正常MG- 63细胞的形态多为梭形或多角形^[17-18].图3为倒置显微镜下MG- 63细胞在HA、PES和PES-HA复合材料环境培养2 d后的生长形态.由图3(a)可见,已贴壁的细胞形态折光性强,多为梭形和多角形,存在明显活细胞增殖,无明显坏死.图3(b)显示细胞大部分为梭形,少量细胞呈球形,细胞贴壁聚集生长,数目较多,与对照组接近,可见HA对细胞增殖抑制作用较小.图3(c)细胞呈梭形或三角形,有少数球形细胞,细胞数目比HA少.图3(d)细胞呈梭形或三角形、细胞密度相对较稀疏.与图3(c)相比,图3(e)细胞数目增多,贴壁生长,呈梭形,可见早期分裂的圆形细胞,说明复合材料B对细胞增殖作用比复合材料A强.图3(f)大量细胞贴壁生长为正常活细胞,许多细胞首尾相连呈聚集状态,与复合材料B相比细胞密度增加,说明复合材料C对细胞增殖作用强.因此,随着HA质量分数增加,PES-HA复合材料对细胞的增殖作用增强.

表5 各组材料的细胞毒性测试结果1)((-overx)±s)
Table 5 Cytotoxicity test results for each group of materials1)((-overx)±s)

图3 HA、PES和PES-HA复合材料对细胞形态的影响(放大倍数为400)
Fig.3 HA, PES and PES-HA composite on cels morphology(magnification is 400)