作者简介:罗 凯(1990-),男(汉族),湖北省安陆市人,四川大学硕士研究生. E-mail:shenatiana@hotmail.com
中文责编:坪 梓; 英文责编:海 潮
四川大学建筑与环境学院,成都 610065
Luo Kai, Liu Dandan, Zhou Lirong, and Chen WenqingCollege of Architecture and Environment, Sichuan University, Chengdu 610065, P.R.China
microbiology; Acacia mearnsii extracts; algal inhibiting agent; Microcystis aeruginosa; allelopathy; inhibition mechanism; ultrastructure; environmental protection
DOI: 10.3724/SP.J.1249.2014.02205
通过检测不同质量浓度黑荆树提取物处理下,不同处理时间段藻细胞浓度与叶绿素a含量的变化,结合细胞膜通透性检测及细胞微观结构,探究黑荆树提取物对藻细胞的抑制机理.研究发现,高浓度的黑荆树提取物降低了铜绿微囊藻细胞浓度和叶绿素a含量,增加了藻细胞膜通透性,藻细胞超微结构呈现明显损伤.黑荆树提取物作用于铜绿微囊藻细胞壁及细胞膜等微观结构,导致细胞膜通透性增加,细胞内物质流失; 在生理指标上表现为藻细胞生物量及叶绿素a含量的降低.
With the treatment of 0, 2, 10 and 20 mg/L algal inhibiting agents, Microcystis aeruginosa growth inhibition was measured by the density of algal cells, content of chlorophy-a, membrane permeability and ultrastructure of algal cell. It is found that 10 and 20 mg/L algal inhibiting agents reduce the concentration of algal cells and content of chlorophyll-a, increase the membrane permeability, and damage the ultrastructure of the algal cell. The Acacia mearnsii extracts increase the membrane permeability of Microcystis aeruginosa by damaging the ultrastructure of the algal cell, leading to the decrease of algal cells and chlorophyll-a.
蓝藻引起的湖泊、河流的水华爆发造成水体缺氧、鱼虾死亡、水质变差以及感官污染.已严重危害生态环境[1].微囊藻水华因产生藻毒素已成为淡水水体中危害最为严重的一类,而铜绿微囊藻是我国常见的水华微囊藻之一[2].常见的水华控制方法包括物理、化学和生物控制方法[3].近年来,因化感作用而备受关注的天然植物提取物被用于水华控制[4],取得显著成果.如小麦杆、黄连[5]、大麦杆[6]、加拿大一枝黄花[7]、山核桃外果皮[8]、野艾蒿[9]、芦苇[10]、广玉兰[11]和稻杆[12]等植物提取物都被证明有很好的抑藻效果.本研究在三峡库区富营养化研究中发现黑荆树提取物有抑藻效果[13],通过现场围格实验[14], 开发出一种以多酚为主要成分的抑藻剂[15], 本实验就黑荆树提取物对铜绿微囊藻的抑制效应作进一步探讨.
铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)购买于武汉中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库,编号为FACHB 927.按淡水藻种库提供的配方配制BG11培养基培养铜绿微囊藻,光照培养箱温度28 ℃,光照强度2 000 lx,光暗比12 h:12 h.
抑藻剂黑荆树提取物(简称XW)购于广西武鸣栲胶厂,呈棕褐色粉末状,其中单宁质量分数≥70%.
取对数生长期铜绿微囊藻(藻密度为107 个/mL[16]),加入XW,设置0、2、10和20 mg/L 4组质量浓度,每组质量浓度设置3个平行样.每天定时取(0、24、48、72和96 h)各组样品测定藻细胞浓度、叶绿素a含量、藻细胞膜通透性,每个样品重复测定3次; 96 h收集0、10和20 mg/L实验组藻细胞做透射电镜.
藻细胞浓度采用血球计数板法测定[17]; 叶绿素a含量采用丙酮-分光光度法测定[17]; 通过测定藻培养液在264 nm处的光密度表征细胞膜通透性[18-19].
分别取96 h(第4天)对照组(0 mg/L)、实验组(10和20 mg/L)培养液20 mL于4 000 r/min下离心10 min浓缩,体积分数为2.5%的戊二醛固定过夜,用0.1 mol/L pH值为7.0的磷酸钠缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗3次,每次浸泡10 min,4 000 r/min离心10 min; 用琼脂预包埋[20],切片后用体积分数为4%的戊二醛及体积分数为1%的锇酸固定,用乙醇进行梯度脱水; 用铀-铅染色,于Tecnai G2 F20型透射电镜下观察,拍照[11,21].
抑藻剂XW对铜绿微囊藻细胞浓度的影响见图1.从图1中藻细胞浓度变化曲线可以看出,加入XW 1 d后,10及20 mg/L实验组藻细胞浓度与对照组比较呈现出差异,表现出抑制作用; 处理3 d后,所有实验组与对照组相比,藻细胞浓度都有所下降,并且随着加入XW质量浓度的增大,抑制效果越明显,实验结束时,各实验组都呈现出显著的抑藻效果(P<0.05).实验结果表明,XW能抑制铜绿微囊藻的生长,降低藻细胞浓度,并且XW质量浓度越高,抑制效果越明显.
图2显示了不同质量浓度XW对铜绿微囊藻叶绿素a质量浓度的影响趋势.10 mg/L和20 mg/L实验组在加入XW后叶绿素a 含量呈下降趋势,且20 mg/L实验组下降趋势明显,第4 d对照组叶绿素a质量浓度为224 μg/L,而20 mg/L实验组为163 μg/L,抑制效果显著(P<0.05). 实验表明,高质量浓度XW能破坏铜绿微囊藻叶绿素a的结构,导致叶绿素a质量浓度降低,且在XW质量浓度增加到10 mg/L及以上时,质量浓度越高,对叶绿素a破坏效果越显著,导致藻光合作用能力的减弱, 从而抑制藻的生长. 实验中发现, 2 mg/L 实验组叶绿素a质量浓度在第3、 4天高于对照组,推测是由于XW中含有的多酚以外其他成分促进了叶绿素a的产生,具体原因有待进一步研究.各实验组叶绿素a质量浓度变化趋势与藻细胞浓度变化趋势大致相似,叶绿素a质量浓度反映了铜绿微囊藻光合作用能力的强弱,叶绿素a质量浓度下降会导致铜绿微囊藻生长缓慢,表现出藻细胞浓度下降.
细胞正常的生理活动必须依靠一个完整的细胞膜结构[22].由图3可知,对照组D(264)一直在0.01左右,细胞膜通透性基本保持稳定; 各实验组D(264)在第1天都急剧增加,随后缓慢减小并保持稳定.随XW质量浓度的增加,D(264)增幅加大.实验表明,XW会立即作用于铜绿微囊藻细胞膜,破坏其完整性,表现为膜通透性增大,且XW质量浓度越高,膜通透性增幅越大,而膜通透性增加会导致细胞内物质外渗,进而导致细胞死亡[23].
铜绿微囊藻细胞超微结构见图4.对照组铜绿微囊藻细胞呈圆形,中央拟核区明显,细胞壁与细胞膜贴合紧密,类囊体[24]清晰、排列规则[25].
10 mg/L实验组的藻细胞形状发生改变,细胞壁与细胞剥离,出现脱落,类囊体片层不均匀,片层结构中间有迂回和缝隙,中央拟核区不明显,不能清晰看到细胞内部的脂肪滴,多面体[26-27]等结构.20 mg/L实验组藻细胞被严重破坏,已经没有完整的细胞,都是不规则的细胞内容物散落体.细胞超微结构的变化表明X对铜绿微囊藻细胞结构的破坏(如细胞壁和细胞膜的破坏),对类囊体片层的损伤,高质量浓度XW甚至导致细胞的解体.
黑荆树提取物会导致铜绿微囊藻细胞膜通透性显著增加,且维持高渗透性,此时细胞内物质容易渗出.超微结构也直观显示了高质量浓度XW对细胞的破坏,细胞壁首先被破坏,紧接着作用细胞膜,细胞内容物包括中央拟核区、脂肪滴和多面体等物质流失,类囊体结构遭到破坏,导致细胞不能完成光合作用和其他正常生理过程,生长缓慢甚至死亡.在生理指标上表现出藻细胞质量浓度下降以及叶绿素a质量浓度下降.
深圳大学学报理工版
JOURNAL OF SHENZHEN UNIVERSITY SCIENCE AND ENGINEERING
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