利用 MEGA6.0 软件neighbor-joining法则的P-距离(P-distance)模型构建进化树,Bootstrap method值为1 000.利用EMBL-EBI计算平台(http://pfam.xfam.org/)对拟南芥的结构域进行分析. 采用Plant CARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析启动子胁迫元件.利用拟南芥数据库e-FP Browser(http://bbc.botany.utoronto.ca/efp)上的AGO基因相对表达信息和胁迫条件下的表达信息,通过Mev生物学软件构建AGO基因组织表达芯片和AGO基因在胁迫下的表达芯片.

拟南芥幼苗在霍格兰德营养液中培养两周后转移到含150 mmol/L氯化钠的霍格兰德营养液中,分别处理0、3、6和12 h,收取3个生物学重复.利用Trizol法提取RNA,反转录成cDNA,设计10种AGO基因的RT-PCR( realtime fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)引物(表1)分析盐胁迫处理不同时间后样品中AGO基因表达量的变化.

表1 RT-PCR检测AGO基因表达引物序列
Table 1 Primer sequence for RT-PCR detection of AGO gene ex-pression

图1 AGO蛋白的进化树
Fig.1 Phylogenetic tree of AGO proteins

通过构建系统进化树分析拟南芥(Arabidopisis thaliana, At)、 无油樟(Amborella trichopoda, Ad)、 苜蓿(Medicago trancatula, Mt)、 衣藻(Chlamy- domonas trichopoda, Cr)、 水稻(Oryza sativa, Os)、 毛果杨(Populus trichocarpa, Pt)、 小立碗藓(Physcomitrella patens, Pp)和卷柏(Selaginella meellendorffii, Sm)等植物中AGO基因家族的进化关系(图1),同时构建拟南芥中AGO蛋白的结构域分布图(图2).结果发现莱茵衣藻、小立碗藓、拟南芥和水稻分别有3、6、10和19种AGO蛋白同源基因.这说明随着进化程度的升高,植物中AGO蛋白的数目和种类也不断增加.另外,AGO蛋白根据其在植物中的进化关系分为2类^[17]. 在拟南芥中,属于第1类蛋白的有AGO1、AGO5和AGO10,结构上都包含Mid结构域,并且AGO1还包含了特殊的甘氨酸富集结构域; AGO2、AGO3和AGO7以及AGO4、AGO6、AGO8和AGO9分别属于第2和第3类蛋白.在拟南芥中,AGO1所形成的RISC复合体是小RNA发挥剪切功能的重要场所.从进化树上可以看到,该AGO蛋白在水稻、毛果杨、卷柏和小立碗藓中都有亲缘关系很近的同源基因(图1).

图2 拟南芥AGO蛋白的结构域
Fig.2 Domain of AtAGO proteins

为探明AGO基因在植物各组织中的表达情况,从拟南芥数据库e-FP Browser中获取了9种AGO基因的表达信息(AGO8除外).分析发现AGO基本表达呈现以下规律:AGO1为组成型表达,除成熟花粉外,其他组织中表达较高; AGO2和AGO3在种子中表达较高,其他组织中表达较低; AGO4除在萼片中没有表达外,其他组织中都有表达; AGO5、AGO7、AGO9和AGO10在花和种子中表达较高; AGO6植株中整体表达较低(图3).以上结果说明AGO基因家族存在明显的组织表达差异性.

通过在线分析软件Plant CARE分析AGO基因转录起始位点上游2 000碱基对(base pair,bp)的启动子序列,发现含有很多非生物响应相关元件(表2).例如,所有AGO基因中都含有厌氧诱导的响应元件,其中AGO2启动子中含有11个厌氧诱导胁迫元件; 含3个以上同一种胁迫元件的有AGO2、 AGO3、 AGO6和AGO9, 其中AGO3基因含ABA应答元件、厌氧诱导元件等多种胁迫元件,且数目都在3个以上; 以上结果说明AGO基因很可能参与非生物胁迫应答.

为了进一步探明拟南芥AGO蛋白与非生物胁迫

图3 AGO在拟南芥各个组织中的表达
Fig.3 Expression profiles of AtAGO genes in various tissues

之间的关系,根据已有的芯片数据,对AGO基因家族(AGO6和AGO8除外)在胁迫下的表达情况进行分析(图4),发现某些AGO基因对非生物胁迫有响应.例如AGO2受基因毒性胁迫诱导表达强烈,且在根部受紫外损伤胁迫诱导表达明显; AGO3在地上部分受冷害、盐和渗透胁迫诱导表达; AGO7受氧化、盐和紫外胁迫诱导表达.相反,也有一些AGO基因在胁迫下,表达下调.例如AGO4在基因毒性、热、盐、紫外和机械损伤胁迫下,基因表达下调明显; AGO9在干旱、渗透、盐和紫外胁迫下,表达下调; AGO10在紫外和机械损伤胁迫下表达下调.另外, AGO1属于组成型表达,所以在各种条件下表达都比较高(图4).综上所述,某些AGO基因在逆境胁迫下有着明显的差异表达.

为进一步验证上述AGO基因受到胁迫诱导表达,通过RT-PCR对拟南芥中10种AGO基因在盐胁迫下的表达进行了分析(图5).结果发现,AGO2、 AGO3和AGO7在盐胁迫下被诱导表达强烈,这与芯片数据一致; 而AGO8基因处理前与处理后皆无信号,说明其在拟南芥中是一个假基因. 总之,通过芯片及RT-PCR的实验数据说明部分AGO基因受到环境胁迫的诱导表达,这说明AGO蛋白可能在植物遭受逆境时,发挥一些特殊功能.

表2 拟南芥AGO基因胁迫相关的启动子元件分析
Table 2 The stress-related promoter element analysis of AtAGOs

图4 拟南芥AGO基因在非生物胁迫下的芯片数据分析
Fig.4 The microarray data of AtAGOs under abiotic stress

图5 拟南芥AGO基因在盐胁迫下的表达分析
Fig.5 The relative expression of AtAGOs under salt stress