心脑浸粉培养基购自美国BD公司; 脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、2,2,2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇购自美国Sigma公司; 抗-GR1、抗CD11b、抗B220和抗CD3荧光标记抗体购自美国eBioScience公司; 苏木精和伊红染色液购自上海碧云天公司; HBSS缓冲液(Hank's平衡盐缓冲液)购于美国Gibco公司; 体积分数4%的多聚甲醛固定液、NH₄Cl、KHCO₃和EDTA化学试剂购自上海生工生物工程股份有限公司.流式细胞仪购自美国BD公司; 石蜡包埋剂、石蜡切片机和荧光正置显微镜购自德国Leica公司.

李斯特菌(listeria)由心脑浸粉培养基于37 ℃培养过夜, 此时光密度D(600)值约为1,菌液浓度为1×10⁸ mL^-1,经PBS洗2遍后稀释至2.5×10⁶ mL^-1.腹腔注射200 μL李斯特菌于体质量和性别相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠,每天记录小鼠存活率和体质量变化. 腹腔注射40 μL李斯特菌于体质量和性别相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠,3 d后处死小鼠,取出肝脏和脾脏后称重,克隆形成实验检测组织中李斯特菌的负荷量.组织中加入1 mL PBS(含有体积分数为0.025%的Triton X-100),经匀浆器研磨得到组织匀浆液,梯度稀释后涂板于脑心浸粉固体培养基培养过夜,统计长出单克隆数目.

体质量和性别相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠,经麻醉后取外周血,取出股骨和胫骨,10 mL HBSS 缓冲液(无Ca²⁺和Mg²⁺)(含有10 g/L BSA和5 mmol/L Hepes)冲出骨髓细胞.腹腔注射400 μL李斯特菌于体质量和性别相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠,4 h后麻醉小鼠,分别取血液和腹腔液.所得细胞经ACK缓冲液(含有0.15 mol/L NH₄Cl、10.0 mmol/L KHCO₃和0.1 mmol/L EDTA)裂解去除红细胞,用PBS(含有10.0 g/L BSA和5.0 mmol/L EDTA)重悬,加入相应流式抗体,冰上避光孵育30 min.染色结束,经PBS洗涤后上机检测,Flowjo软件分析实验结果.

腹腔注射1×10⁵个李斯特菌于体质量和性别相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠,3 d后处死小鼠,取出肝脏立即放入体积分数为4%的多聚甲醛固定过夜.腹腔注射LPS(15 mg/kg)于体质量和性别相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠,8 h后处死小鼠,取出肺组织立即放入体积分数为4%多聚甲醛固定过夜.固定后的组织经酒精脱水和二甲苯透明后,制备石蜡切片.依次经苏木精和伊红染色后,显微镜下观察REGγ敲除对免疫细胞浸润能力的影响,并采集图片.

实验所得数据经GraphPad Prism软件处理,数据以平均值((-overx)±s)表示,两组数据差异性比较采用t-test(非参数检验)方法进行分析.小鼠存活率经Kaplan-Meier生存分析,数据差异性比较采用log-rank test. P<0.05表示差异具统计学意义, P<0.01表示差异具显著性, P<0.001表示差异具非常显著性, P>0.05则表示差异无统计学意义(no significance,NS).

分别腹腔注射200 μL李斯特菌于野生型(REGγ^+/+)和REGγ敲除小鼠(REGγ^-/-)各10只,每天记录两组小鼠存活率和质量的变化.结果如图1,与野生型小鼠相比,李斯特菌感染后REGγ敲除小鼠的存活率和体重下降较快.

图1 李斯特菌感染后,野生型和REGγ敲除小鼠存活率和质量变化
Fig.1 The changes of survival rateand average body weight of wild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection

分别腹腔注射40 μL李斯特菌于6只野生型和7只REGγ敲除小鼠,3 d后取出肝脏和脾脏,组织匀浆后梯度涂板.结果如图2,与野生型小鼠相比,李斯特菌感染后REGγ敲除小鼠的组织匀浆液长出的单克隆数目远多于野生型的小鼠的组织,每克组织经匀浆后再培养长出的细菌数论作n. 由图2可见,REG敲除小鼠抵抗李斯特菌感染的能力较弱.

为了检测REGγ对免疫细胞浸润的影响,本研究比较了生理条件下,野生型和REGγ敲除小鼠骨髓和外周血中B(B220⁺)淋巴细胞、T(CD3⁺)淋巴细胞、中性粒细胞(GR1⁺ CD11b⁺)和单核细胞(GR1^- CD11b⁺)的分布差异.静息状态下,分别提取野生型和REGγ敲除小鼠的骨髓和外周血细胞,各3只,裂解红细胞后,流式细胞术检测各细胞所占百分比的差异.结果如图3,REGγ敲除对骨髓和外周血中各细胞所占的百分比没有影响.

分别腹腔注射400 μL李斯特菌于野生型和REGγ敲除小鼠各6只,4 h后提取骨髓和外周血细***表示P<0.00

图2 李斯特菌感染后,野生型和REGγ敲除小鼠肝脏和脾脏的细菌负荷量
Fig.2 Bacterial load in liver and spleen of wild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection

胞.裂解红细胞后,流式细胞术检测中性粒细胞(GR1⁺ CD11b⁺)和单核细胞(GR1^- CD11b⁺)所占百分比的差异.结果如图4,相对野生型小鼠,李斯特菌感染后REGγ敲除小鼠中中性粒细胞和单核细胞所占腹腔液细胞的百分比明显降低,如图4(a)、(b)和(c),外周血中中性粒细胞所占百分比也显著降低,而单核细胞所占外周血细胞的百分比没有差异,如图4(a)、(d)和(e).

分别腹腔注射40 μL李斯特菌于野生型和REGγ敲除小鼠各6只,3 d后取出肝组织.此外,分别腹腔注射LPS于野生型和REGγ敲除小鼠各6只,8 h后取出肺组织.肝和肺组织经多聚甲醛固定,石蜡切片后进行HE染色.结果如图5,与未感染小鼠组织相比,李斯特菌感染或LPS注射菌均介导不同程度的免疫细胞浸润.但是,REGγ敲除小鼠肝组织中免疫细胞浸润明显低于野生型小鼠,如图5(a),REGγ敲除小鼠肺组织中免疫细胞浸润也明显低于野生型小鼠,且损伤程度也低于野生型小鼠,如图5(b).

图3 生理条件下,野生型、REGγ敲除小鼠中B、T淋巴细胞和中性粒细胞在骨髓和外周血细胞中的比例
Fig.3 Percentage of B,T lymphocytes and neutrophils, monocytes in bone marrow and peripheral blood of wild-type and REGγ-knockout mice under physiological condition

图4 李斯特菌感染后,野生型和REGγ敲除小鼠中中性粒细胞和单核细胞向腹腔和外周血中的浸润
Fig.4 Infiltration of neutrophils andmonocytes to peritoneal cavity and peripheral blood ofwild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection

图5 李斯特菌感染和LPS注射后,野生型和REGγ敲除小鼠中免疫细胞向肝脏和肺组织的浸润
Fig.5 (Color online)Immune cells infiltration to liver and lung of wild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection and LPS injection