ASR(abscisic acid, stress, ripening-induced)基因是植物中一类受脱落酸(abscisic acid,ABA)、胁迫和果实成熟诱导表达的基因.Gonzalez等^[1]首次从西红柿叶中分离出了ASR基因,并在30余种单子叶和双子叶植物中克隆到ASR基因.然而,在模式植物拟南芥中未发现ASR同源基因^[2].ASR基因可编码分子质量相对较小的碱性蛋白质(10～30 kDa),富含甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸以及组氨酸,具有较高的亲水性及热稳定性.ASR蛋白序列中通常含有3～5个保守区,不同ASR蛋白具有不同的保守区域,每个保守区都富含组氨酸^[3].

ASR蛋白的表达模式具有多样性,ABA、胁迫和果实成熟过程都可以诱导植物体内ASR基因表达^[4-5].如ABA存在条件下,香蕉mAsr3和mAsr4的相对表达量上升显著^[6].干旱胁迫可诱导西红柿叶中的ASR1和ASR2基因表达上调,然而在根中只有ASR2基因表达上调^[7].铝胁迫时,水稻ASR5基因的转录水平上升^[8].ASR基因表达模式的多样性意味着ASR蛋白可能参与植物细胞对多种环境信号的响应.一些转基因实验也证明,ASR基因的过表达能提高植物对非生物胁迫的耐受力,如大蕉MpASR基因的过表达可使转基因拟南芥耐旱性提高^[9]; 百合花粉LLA23基因(ASR)和番茄ASR1基因的过表达可分别使转基因拟南芥和转基因烟草的耐盐性提高^[10-11].ASR蛋白可通过多种机制提高植物的抗逆功能,如体外实验证明,西红柿ASR1蛋白能够保护乳酸脱氢酶、限制性内切酶Sma I等的活性^[12].西红柿ASR1蛋白在Zn²⁺存在时能与DNA结合,可能起到转录因子的作用^[13].ASR基因在植物细胞中的保护功能和保护机制仍需要进一步研究.

Cu²⁺是植物生长和发育的必需微量元素,但过量Cu²⁺积累会对植物细胞产生毒害作用^[14].如前所述,ASR蛋白可能参与植物对干旱、高盐和铝胁迫的保护作用,然而它能否提高植物对重金属离子(如Cu²⁺)胁迫的耐受性还不清楚.大豆基因组编码3个ASR蛋白(Glyma10g36890.1、Glyma16g28150.1和Glyma20g30720.1),本实验室克隆得到第3个GmASR基因(Glyma20g30720.1),先前的研究表明,大豆GmASR蛋白具有结合Fe³⁺和Zn²⁺的特性,并能减少由Fe³⁺产生的羟基自由基^[15].本研究检测了在Cu²⁺胁迫过程中,大豆幼苗GmASR基因的表达模式,并证明大豆GmASR基因表达可提高Cu²⁺敏感酵母突变株和转基因烟草悬浮细胞对Cu²⁺的耐受力,探讨了ASR蛋白对植物细胞保护的分子基础.

现代冶炼、金属加工、机器制造及其他工业废水中都含有铜,其中,以金属加工和电镀工厂所排废水含铜量最高.这种废水排入水体,会影响水和土壤的质量.Cu²⁺影响植物生长和发育.植物受到Cu²⁺胁迫时,会表达多种蛋白质用于减轻胁迫带来的细胞伤害,ASR蛋白是其中重要的一类植物保护性蛋白.本研究结果证明,在Cu²⁺胁迫过程中,幼苗的叶片和根部GmASR基因的表达量在胁迫3 h和24 h(或48 h)出现2次峰值,表明大豆GmASR基因对Cu²⁺胁迫存在快速应答和慢速应答.快速应答是植物对周围环境变化的应激性反应,而慢速应答是植物在较长时间胁迫下产生的适应性反应,即胁迫耐受性^[19]. GmASR基因的表达受到 Cu²⁺胁迫的诱导,说明它可能与植物的抗Cu²⁺胁迫有关.而转基因实验也证明,GmASR基因的过表达确实能提高重组酵母和转基因烟草细胞的抗Cu²⁺能力.

非生物胁迫可以在生理水平和代谢水平上对植物造成影响,如细胞膜稳定性降低、水分丧失、离子平衡失调和离子毒害等,其中,金属(Cu、 Fe、 Cd和Pb等)离子浓度的升高可以催化活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)的产生,继而对细胞造成氧化伤害^[20].已有研究结果证明蛋白质序列中的组氨酸可结合金属离子,减轻对细胞的氧化伤害.大豆GmPM1和GmPM9蛋白(LEA4)以及柑橘CuCOR19蛋白(LEA2),可通过其序列中的组氨酸结合Fe³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺等金属离子,具有清除羟自由基和过氧自由基的功能^[21-22].Hara等^[18]也证明拟南芥中的AtHIRD11蛋白(LEA2)能减少由Cu²⁺产生的ROS,并且组氨酸是ROS清除的重要氨基酸.大豆GmASR蛋白含有高比例(9.8%)的组氨酸.文献[15]的研究已证明,GmASR蛋白可以与Fe³⁺结合,并降低Fe³⁺催化的羟基自由基.本研究用体外实验证明,GmASR蛋白可直接与Cu²⁺结合.推测植物受到Cu²⁺胁迫时,表达的GmASR可螯合细胞内高浓度的Cu²⁺,减轻Cu²⁺的毒害作用,降低ROS引起的氧化伤害.因此,利用植物表达ASR蛋白在治理环境中Cu²⁺污染可能有潜在应用前景.

利用酵母突变体及功能互补实验,可准确地鉴定基因的功能.本实验利用的是Cu²⁺敏感型酵母ΔCUP2, CUP2基因是Cu²⁺可诱导的转录因子,当酵母细胞的CUP2基因发生突变后,不能启动下游的Cu²⁺结合蛋白CUP1的表达,造成细胞内Cu²⁺积累过多,对细胞产生毒害^[23].本研究构建了可表达大豆GmASR蛋白的酵母载体,转化Cu²⁺敏感型酵母ΔCUP2, 证明GmASR蛋白的表达可以提高酵母突变体耐Cu²⁺胁迫的能力,即对Cu²⁺敏感型酵母细胞中CUP2基因的缺失起到了补偿应.这一结果进一步支持了前述“ASR蛋白可通过结合Cu²⁺,参与植株对Cu²⁺胁迫的耐受性”的结论.

研究了大豆GmASR基因的表达能提高转基因重组型酵母和烟草细胞对Cu²⁺胁迫的耐受力.实时荧光定量PCR结果表明,Cu²⁺可以诱导大豆幼苗内GmASR基因的表达.体外实验固相金属螯合亲和层析和内源荧光法证明GmASR蛋白可直接螯合Cu²⁺,羟基自由基清除实验证明GmASR蛋白具有抗氧化能力,植物细胞中的ASR蛋白可以通过螯合多余的金属离子,起到保护植物细胞的作用.