本实验采用LC-20AD XR型高效液相色谱仪(日本岛津公司); Heidolph 4003型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司); UV 2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司); 氮吹仪(北京康林科技有限公司); Milli-Q纯水仪(Millipore公司); 0.45 μm滤膜(德国Membrane公司).

2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯标准品纯度均为99.5%,均由德国Dr. Ehrenstorefer GmbH公司提供; 乙腈(色谱纯)由Merck公司提供.

缓冲溶液为0.02 mol/L磷酸二氢铵-磷酸氢二钠溶液. 取0.575 g磷酸二氢铵和0.7 g磷酸氢二钠溶液,溶于1 000 mL二次蒸馏水中,用磷酸调节pH=4.50.

准确称取2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯标准品,用乙腈溶解,配制标准溶液储备液. 移取适量体积的各标准溶液储备液,置于25 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成混合标准溶液储备液,该溶液中2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯的质量浓度分别为88.8、82.4、87.2和80.0 μg/mL. 使用时,用乙腈逐级稀释至所需浓度.

按GB/T 17592—2011^[15]或EN 14362—1:2012^[16]处理样品.

色谱柱为岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱(100 mm×3.0 mm×2.2 μm),柱温为50 ℃; 进样量为1.0 μL,流速为0.8 mL/min,流动相为乙腈(A)-缓冲溶液(B). 采用梯度淋洗方式,开始时, A的体积分数是10%, B的体积分数是90%,保持1 min; 淋洗5 min时, A的体积分数是14%, B的体积分数是86%; 2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯的检测波长分别为233、234、232和232 nm.

2,4-二氨基甲苯及其同分异构体含有相同的官能团,但官能团的位置各不相同,因此其紫外-可见吸收光谱稍有差异,图1为4种化合物的紫外-可见光吸收光谱图,在220～320 nm区间内,2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯均出现2个吸收峰,最大吸收峰波长分别为233、234、232和232 nm,另一强吸收峰波长分别为284、288、285和288 nm. 对于2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯、3,4-二氨基甲苯,分别选择233、234、232和232 nm为其检测波长. 从图1可以看出,在质量浓度相近的条件下,2,6-二氨基甲苯的光密度明显大于其他3个同分异构体.

图1 紫外-可见吸收光谱
Fig.1 UV-visible spectra

2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯均易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂,适于采用反相色谱进行分离测定. 高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定禁用偶氮染料时,通常采用甲醇-缓冲溶液体系作为流动相,缓冲溶液为pH=6.9的NH₄HPO₄-NaH₂PO₄. 在此条件下,改变梯度淋洗参数,观察分离效果,发现4个同分异构体的出峰次序为3,4-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,3-二氨基甲苯和2,6-二氨基甲苯. 其中,3,4-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯之间能较好分离,但2,3-二氨基甲苯则与2,6-二氨基甲苯完全重叠.

洗脱液的极性直接影响反相HPLC的分离效果^[17-18],改变流动相中缓冲溶液的pH值,观察流动相极性对分离效果的影响. 研究发现,4个同分异构体的出峰次序发生改变,为2,6-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、3,4-二氨基甲苯和2,3-二氨基甲苯. 随着缓冲溶液pH值的下降,2,3-二氨基甲苯则与2,6-二氨基甲苯逐渐分离开来. 当pH=5.0时,2,3-二氨基甲苯则与2,6-二氨基甲苯间的分离度达到1.04; 当pH=4.5时,两者已完全分离; 当pH值继续下降时,分离度进一步加大. 随着pH值的降低,各组分的保留时间逐渐缩短,这在一定程度上不利于各组分之间的分离. 综合考虑,当pH=4.5时,各组分能完全分离,且各组分的保留时间也比较合适,分离效果最佳.

在缓冲溶液pH=4.5的条件下,改变流动相的起始组分和淋洗梯度,观察分离效果的变化. 结果发现,当采用1.4节中的梯度淋洗条件时,分离效果最佳,各色谱峰峰形尖锐,对称性好,4个色谱峰之间完全分离,其分离度分别为R(2,4-二氨基甲苯与2,6-二氨基甲苯)=2.9, R(3,4-二氨基甲苯与2,4-二氨基甲苯)=15.1, R(2,3-二氨基甲苯与3,4-二氨基甲苯)=4.5.

流动速度也对分离效果有影响. 若维持其他条件不变,改变流动速度,观察流动速度对分离效果的影响,结果发现,流动速度减小时,各色谱峰的保留时间增大,色谱峰的峰形展宽,峰形对称性下降,各色谱峰之间的分离度增大; 流动速度增大时,各色谱峰的保留时间减小,色谱峰对称性增加,峰形变窄,各色谱峰之间的分离度减小. 同时,色谱柱的柱压明显增加. 综合考虑,最终确定的流动速度为0.8 mL/min.

保持其他条件不变,改变色谱柱温度,观察分离效果的变化,结果发现,随着色谱柱温的升高,柱压迅速下降,分离效果变差. 由于流动相为乙腈–缓冲溶液体系,导致色谱柱压较高,必须维持一定的色谱柱温,才能确保色谱柱压不超出其最大允许值. 综合考虑,最终确定柱温为50 ℃.

在上述条件下,对2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯和3,4-二氨基甲苯混合标准溶液进行分离,结果如图2所示.图2中各色谱峰峰形对称性好,谱峰尖锐,各色谱峰之间分离完全. 在质量浓度相近的条件下,2,6-二氨基甲苯的色谱峰明显大于其他3个同分异构体,这一结果与图1一致.

图2 混标的HPLC图
Fig.2 HPLC chromatogram of mixed standards

在本方法确定的条件下,对于不同质量浓度混标溶液进行测定,结果表明,在一定质量浓度(ρ)范围内,其色谱峰面积(A)与ρ之间存在良好的线性关系.表1给出了各组分的线性关系及检测波长. 以不含上述4个组分的白衬布为空白样品,添加不同质量浓度的混标液进行测定,确定方法的检出限. 在信噪比(S/N)=3时,得到各组分的检出限,见表1.

以不含上述物质的白色棉衬布为空白样品,分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液,测定方法的回收率,结果见表2. 在3个添加水平下,2,3-二氨基甲苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯、3,4-二氨基甲苯的回收率分别为64.98%～78.90%、65.06% ～ 81.57%、63.67%～76.43%和68.74%～78.55%,均满足相关标准对回收率的要求. 各添加水平下,各组分的回收率实验相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)值均小于5%.

表1 线性关系及检出限
Table 1 Linear relationship and detected limits

表2 精密度与回收率*
Table 2 Precision and recovery

采用GC/MS单柱法对纺织品进行测定,筛选出可能含有2,4-二氨基甲苯的样品,然后利用本研究建立的方法进行确认. 若样品在与标准品相同的保留时间处出现吸收峰,且其紫外-可见吸收光谱与标准品的紫外-可见吸收光谱一致,则确认为阳性样品; 若保留时间内虽然相同,但其紫外-可见吸收光谱不一致,则确认为假阳性样品. 在87个样品中,11个样品检出2,4-二氨基甲苯,4个样品检出2,3-二氨基甲苯,其余样品中均未检出2,4-二氨基甲苯及其同分异构体. 图3给出了2个典型样品的HPLC图,其中1^#样品为涤棉经编针织提花染色布,该样品中检出2,4-二氨基甲苯,质量分数为42.2 mg/kg; 2^#样品为平纹机织染色棉布,该样品中检出2,3-二氨基甲苯,质量分数为18.5 mg/kg. 图2中,2^#样品在1.42 min处出现一个吸收峰,该吸收峰与2,4-二氨基甲苯保留时间一致,但其紫外-可见吸收光谱与2,4-二氨基甲苯不同,从而判定该吸收峰不是2,4-二氨基甲苯.

图3 实际样品的HPLC图
Fig.3 HPLC chromatograms of real samples